স্ত্রী Anopheles মশার কামড়ে বা blood transfusion এর মাধ্যমে মানুষের শরীরে malarial parasite প্রবেশ করে।
Malarial parasite চার ধরনের:
- 1. Plasmodium falciparum
- 2. Plasmodium vivax
- 3. Plasmodium malariae
- 4. Plasmodium ovale
আমাদের দেশে দুই ধরনের malarial parasite পাওয়া যায়:
- 1. Plasmodium vivax
- 2. Plasmodium falciparum
Malarial parasite diagnosis এর জন্য রোগী থেকে blood collection করে thick এবং thin film তৈরী করে Giemsa stain বা Field stain করে microscope এ দেখতে হয়।
Blood collection:
Malarial parasite এর উপস্থিতি নির্ণয়ের জন্য রোগীর শরীরে জ্বর থাকা অবস্থায় blood collection করতে হবে, কারণ এ অবস্থায় blood malarial parasite এর উপস্থিতি বেশী থাকে। রোগীর বাম হাতের thumb থেকে শুরু করে ৩য় বা ৪র্থ আঙ্গুল থেকে blood collection করতে হবে। বাচ্চাদের great toe থেকে blood collection করা হয়।
Thin এবং thick film তৈরী:
Thin Film: DLC-র জন্য যেভাবে microscopic slide এ film তৈরী করা হয়, একইভাবে spreader এর সাহায্যে one small drop blood দিয়ে thin film তৈরী করতে হবে।
Thick film: একটি microscopic slide এ one drop blood নিয়ে একটি spreader এর কোণের সাহায্যে blood ছড়িয়ে ১/৩ ইঞ্চি ব্যাস ( 1/3 inch diameter) বিশিষ্ট thick film তৈরী করতে হবে। Film টিকে flat position এ রেখে শুকাতে হবে।
পৃথক পৃথক slide এ thick এবং thin film তৈরী করা উত্তম, যদিও কাজের সুবিধার্থে আমরা একই slide এ thick এবং thin film তৈরী করে থাকি।
একই slide এ thin এবং thick film তৈরী করার পদ্ধতি:
একটি microscopic slide এর এক পাশে one small drop blood নিয়ে spreader এর এক কোণের সাহায্যে 1/3 inch diameter এর একটি thick film তৈরী করতে হবে। এর পাশে পুনরায় one small drop blood নিয়ে spreader এর সাহয্যে নীচের ছবির মত একটি thin film তৈরী করতে হবে। Flat level position এ রেখে thick এবং thin film শুকাতে হবে।
Staining of blood film with giemsa stain:
>> Stain করার পূর্বে thin film fix করে নিতে হবে।
>> Thin film কে methanol ভর্তি jar এ কয়েক সেকেন্ড ডুবিয়ে film fix করতে হবে।
>> Thick film কখনো fix করা যাবে না।
>> Thin film fix করার সময় সতর্ক থাকতে হবে যেন কোন ক্রমেই methanol thick film স্পর্শ করতে না পারে।
(অভিজ্ঞ technologist গণ এক টুকরা cotton methanol এ ভিজিয়ে এর কোমল স্পর্শে thin film এর উপর দিয়ে নিয়ে film টি fix করে থাকেন।)
>> প্রয়োজন অনুযায়ী giemsa stain এর 3% solution তৈরী করতে হবে। (3ml giemsa stock solution +97ml buffered water or distilled water; pH 7.2)
>> একটি staining trough তে slide গুলো সঠিক ভাবে বসাতে হবে।
>> ধীরে ধীরে staining trough তে 3% giemsa stain দিয়ে slide গুলো ঢেঁকে দিতে হবে ।
>> এ অবস্থায় 30-45 minutes রাখতে হবে।
>> ধীরে ধীরে staining trough তে পরিষ্কার পানি ঢালতে হবে। (to remove the deposit on the surface of the staining solution)
>> ধীরে ধীরে staining trough থেকে stain ফেলে দিতে হবে।
>> পুনরায় staining trough এ পরিষ্কার পানি দিয়ে slide গুলো কয়েক সেকেন্ড ডুবিয়ে রাখতে হবে এবং তারপর পানি ফেলে দিতে হবে।
>> Forcep এর সাহায্যে slide গুলো তুলে একটি slide rack এ রাখতে হবে এবং শুকাতে হবে।
>> Film ভালভাবে শুকিয়ে গেলে film এ immersion oil দিয়ে microscope এর 100x objective এ দেখতে হবে।
Rapid method for staining thick & thin blood film:
>> Film তৈরীর পর fan এর নীচে বা incubator এ রেখে film শুকাতে হবে।
>> Thin film methanol এ fix করতে হবে।
>> 10% Giemsa solution তৈরী করতে হবে। (স্বল্প পরিমান stain এর জন্য 1ml buffered or distilled water এর সাথে 3 drops giemsa stock solution mix করে ব্যবহার করা যায়।)
>> Pipette এর সাহায্যে slide এর উপর giemsa solution দিয়ে film ঢেঁকে রাখতে হবে।
>> এভাবে 5-10minutes রাখতে হবে।
>> Slide এর উপর থেকে stain ফেলে না দিয়ে slide এর উপর ধীরে ধীরে clean water ঢেলে slide wash করতে হবে।
>> Slide rack এ slide রেখে air dry করে film এ immersion oil দিয়ে microscope এর 100x objective এ দেখতে হবে।
Microscopic examination:
>> Slide শুকানোর পর immersion oil দিয়ে microscope এর 100x objective এ দেখতে হবে।
>> Thick blood film এ clean background এ malarial parasite গুলোর deep red chromatin এবং blue or pale purplish-blue cytoplasm দেখা যাবে।
>> Thick film দেখে parasite এর উপস্থিতি সহজে সনাক্ত করা যায় এবং parasite এর density নির্ণয় করা হয়।
>> Thin film এ আক্রান্ত erythrocytes অপরিবর্তিত থাকে এবং এর মধ্যে pink colour (Schilffner’s) or red colour ( “James”) dot থাকে।
>> Thin film দেখে malarial parasite এর ধরণ (plasmodium falciparum, vivax, ovale, malariae) নির্ণয় করা সম্ভব।
Reporting:
>> Thick এবং thin film ভালভাবে দেখার পর malarial parasite না পাওয়া গেলে আমরা malarial parasite not found লিখে থাকি।
>> Malarial parasite পাওয়া গেলে report এ উল্লেখ করতে হবে চার ধরণের parasite এর মধ্যে (plasmodium falciparum vivax, ovale, malariae) কোন ধরণের parasite পাওয়া গেছে এবং কোন stage এর parasite উপস্থিত।
Film এ parasite এর উপস্থিতির পরিমাণ দেখতে হবে এবং উপস্থিতির পরিমাণ report এ নিম্ন পদ্ধতিতে (+, ++, +++, ++++) লিখতে হবে।
যেমন thick film এর:
- 100 fields এ যদি 1-10 parasites থাকে তাহলে report এ ‘+’ লিখা হয়।
- 100 fields এ যদি 11-100 parasites থাকে তাহলে report এ ‘++’ লিখা হয়।
- প্রতি field এ যদি 1-10 parasites থাকে তাহলে report এ ‘+++’ লিখা হয়।
- প্রতি field এ যদি more then 10 parasites থাকে তাহলে report এ ‘++++’ লিখা হয়।
Giemsa stain প্রস্তুতি:
Powder of Giemsa stain – – – – – 0.75g
Methanol (CH3OH) – – – – – 65ml
Glycerol (C3H8O3) – – – – – 35ml
Buffered water (pH 7.2) প্রস্তুতি (For giemsa and leishman stains):
Di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO42H2O) – – – – 3.8g
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Anhydrous – – – – – 2.1g
Distilled water – – – – – 100ml