Slide এ Blood Film তৈরীর পদ্ধতি (Thin film):
>> একটি পরিষ্কার microscopic slide নিয়ে slide এর এক প্রান্তে ১ ফোঁটা রক্ত নিতে হবে।
>> একটা spreader নিয়ে রক্তের ফোঁটাটির সামনে slide এর উপর 45° কোন করে spreader টি রেখে প্রথমে একটু পেছনে টেনে রক্তের ফোঁটাটির সাথে স্পর্শ করাতে হবে।
>> যেন spreader এর সামনের দিকের প্রান্তে রক্তটা ভালভাবে ডানে-বামে ছড়ায়।
>> এবার spreader টিকে slide এর সামনের দিকে এক গতিতে ঠেলে নিয়ে film তৈরী করতে হবে।
>> Film টি বাতাসে শুকিয়ে নিতে হবে।
>> শুকানোর পর stain করে microscope এ দেখতে হবে।
Blood Film Stain করার পদ্ধতি:
Blood film দুই ধরনের stain দ্বারা stain করা যায় :
1.Leishman’s stain.
2.Giemsa’s stain.
1.Leishman’s Stain করার পদ্ধতি:
>> Slide এর উপর কয়েক ফোঁটা Leishman’s stain দিয়ে সম্পূর্ন film টি ঢেকে ১ ২ মিনিট অপেক্ষা করতে হবে।
>> এবার slide এর উপর যতটুকু stain দেয়া হয়েছে এর দ্বিগুণ distilled waterদিতে হবে।
>> একটা Glass pipette বা ESR pipette এর সাহায্যে ফু দিয়ে stain এবং distilled water মিশিয়ে দিতে হবে।
>> ৭-৮ মিনিট এভাবে রেখে দিতে হবে।
>> এবার slide টিকে distilled water দিয়ে ভালভাবে ধুয়ে বাতাসে শুকাতে হবে এবং শুকানোর পর microscope এ দেখতে হবে।
Leishman’s Stain তৈরীর নিয়ম:
Leishman powder – – – – – 0.15 gm
Acetone free methyl alcohol – – – – – 100 ml
খেয়াল রাখতে হবে যেন alcohol এ Leishman powder ভালভাবে গলে যায় ও মিশে যায়। stain তৈরীর পর একটা কাঁচের রঙ্গীন বোতলে ভালভাবে মুখ বন্ধ করে রেখে দিতে হবে। (বর্তমানে বাজারে Rankem, India এবং Tulip, India -র তৈরী মানসম্মত Leishman stain পাওয়া যায়।)
Blood film ভালভাবে Stain না হওয়ার কারন:
1. Stain যদি খুব বেশী পুরানো বা নষ্ট হয়।
2. Slide যদি অপরিস্কার থাকে।
3. Stain তৈরীতে ভুল থাকলে।
4. সঠিক পদ্ধতিতে stain না করলে।
5. Slide এ stain দেয়ার পর stain এর উপর যে distilled water দেয়া হবে এর pH 7-7.4 এর মধ্যে না হলে।
Microscope এ Film দেখার নিয়ম (DC Slide):
>> উপরের ছবির মত এক প্রান্ত থেকে গুনতে গুনতে অন্য প্রান্তে যেতে হবে।
>> প্রথমে 10x objective দিয়ে film টি দেখতে হবে stain ঠিক হয়েছে কি না এবং cell সমূহ ঠিকভাবে ছড়িয়ে আছে কি না।
>> তারপর হেমোগ্রাম ছক (১০০টি ঘরওয়ালা ছক) বা cell counter নিতে হবে।
>> 40x objective দিয়ে বা 100x objective এ slide এর এক প্রান্ত থেকে প্রতি field এ কয়টি polymorph, lymphocyte, eosinophil, monocyte, Basophil পাওয়া যায় তা হেমোগ্রাম ছকে লিখতে হবে বা cell counter এ চেপে হিসাব রাখতে হবে। WBC-র সংখ্যা ১০০টা না হওয়া পর্যন্ত slide দেখতে হবে। Haemogram ছকের ১০০ ঘর পূর্ণ হলে বা cell counter এ ১০০টি cell count হলে দেখতে হবে ১০০টি WBC-র মধ্যে polymorph কয়টি lymphocyte কয়টি, monocyte কয়টি, eosinophil কয়টি এবং basophil কয়টি। হেমোগ্রাম ছক থেকে গুনে বা cell counter থেকে তা হিসাব করে report এ লিখতে হবে।
হেমোগ্রাম ছক বা DLC ছক
ছকের Report :
Differential Count of WBC (DC):
Polymorph – – – – – 56%
Lymphocyte – – – – – 35%
Monocyte – – – – – 02%
Eosinophil – – – – – 07%
Basophil – – – – – 00%
DLC (DC) Slide দেখে TLC করার পদ্ধতি:
DLC থেকে TLC করার কোন নির্ধারিত বা স্বীকৃত পদ্ধতি নেই। DLC থেকে TLC করার পদ্ধতি সমূহ বিশেষজ্ঞ প্যাথলজিষ্টদের নিজেদের অভিজ্ঞতার আবিস্কার। অভিজ্ঞত না থাকলে বা নতুন কাজ শুরু করলে এ পদ্ধতিতে TLC না করাই উত্তম।
DLC থেকে TLC করার কোন সুনির্দিষ্ট পদ্ধতি না থাকলেও অভিজ্ঞ Pathologist. দের এ ক্ষেত্রে ভুল হওয়ার সম্ভাবনা থাকে না। DLC থেকে TLC করতে হলে প্রথমে অভিজ্ঞতা অর্জন করতে হবে। যেমন প্রথম অবস্থায় প্রতিটি রোগীর TLC এবং DLC ভালভাবে দেখতে হবে এবং খেয়াল করতে হবে TLC কত হলে DLC film এর প্রতি high power field এ কয়টি WBC থাকে। এভাবে দেখতে দেখতে নিজেই নির্ধারন করতে হবে DLC slide এর flim এর TLC কত হবে।
কোন কোন বিশেষজ্ঞ Pathologist এর মতে DLC Slide এর বিভিন্ন অংশের কমপক্ষে 10 টি HPF এ WBC-র সংখ্যা গুনে 10 দিয়ে ভাগ দিতে হবে, তাহলে প্রতি HPF এ WBC-র গড় পাওয়া যাবে। এবার প্রতি field এ গড়ে যে সংখ্যক WBC পাওয়া যায় ঐ সংখ্যাকে ১৫০০ দিয়ে গুন করলে যা হবে তাই প্রতি cmm এ WBC-র সংখ্যা। অর্থাৎ DLC slide এর film এর 10 টি HPF এ যদি 50 টি WBC থাকে তাহলে,
TLC=50/10 x 1500=7500/cmm
এ পদ্ধতিটি DLC থেকে TLC করার কোন সঠিক বা নির্ভুল পদ্ধতি নয়। শুধুমাত্র ধারনা দেয়ার জন্য এ পদ্ধতিটি আলোচনা করা হল। Film তৈরীর ধরন এবং microscope এর ভিন্নতার জন্য এ পদ্ধতিতে যে প্রতি field এর গড় WBC কে 1500 দিয়ে গুণ দেয়া হয় এ সংখ্যাটি পরিবর্তন হতে পারে।